2.细胞蜡块的制作。CB是针吸细胞学检查标本制备的又一选择，其基本原理是将针吸取得的样本先用生理盐水或85%酒精全部冲刷下来，再将液体中的样品通过离心浓缩后处理成块状，石蜡包埋切片再进行观察的细胞病理学技术。其在某种程度上具备组织切片的特点，主要优点有：
①最大限度保留了残存的组织学结构、细胞及小组织碎片相对集中，有助于获得更多的诊断信息。
②可重复多次切片，便于进一步开展特殊染色、免疫组织化学、分子病理学等辅助检查。
③背景清晰，血细胞、炎症细胞数量较少。
必须指出，优质的CB必须建立在成功的穿刺操作基础上，需要有较大数量的细胞，制作过程也相对复杂；然此项技术为获得更多的诊断线索提供了新的途径。FNAC检查样本中，CB的制作成功率在60%～80%不等，CB的制作通常是在穿刺常规涂片后进行的，材料过少时考虑重新穿刺取材供CB用。CB常用的制作方法有以下几种：
（1）琼脂细胞蜡块（CB首选方法）。
①85%酒精液或生理盐水冲洗针尖、针管内的针吸材料，反复冲洗至材料完全脱落，液体用50ml尖底管存放。
②1500r／min离心沉淀，10min，弃上清液。
③10%中性缓冲福尔马林20ml混匀30～60s，离心沉淀（2500～3000r／min，3～5min）。
④熔化琼脂（≤80℃）后加入到10ml试管中，并用玻棒搅拌混匀沉淀物，避免气泡，加入4～5滴伊红染液或Mayer苏木精染液。
⑤2000r／min，10min，放进冰箱内冷藏（而不是冷冻）。
⑥凝集好的琼脂取出后修整，保留着色部分小块，切除多余部分。
⑦琼脂块放入脱水盒内常规处理，制作切片。
⑧切片可选择常规染色、特殊染色、免疫组化、分子病理学检测，同时也适用于电子显微镜（Jotannssen，1877）。
⑨应注意的事项：a.尽可能地增加细胞量，必要时增加穿刺次数。
b.反复冲洗针筒、针尖。
c.琼脂温度不能＞80℃，同时保证固定的时间。
（2）血浆凝血块法。方法似前，但加入的凝固剂为血浆，同时也可考虑穿刺过程中吸入一定的血液成分自然凝集成块，然后做固定、脱水、包埋处理。
（3）酒精凝集法。
①吸取的标本直接注入85%酒精液内（20～30ml），若标本血液成分多，则先注入含10%冰醋酸的25%酒精振荡10min，以去红细胞，再注入85%酒精液（20～30ml）。
②振荡打散10～30min不等。
③2500～3000r／min快速离心5min。
④静置2h。
⑤弃上清酒精，取出已凝集的细胞团滤纸包裹，脱水、透明、浸蜡、包埋、切片。
（4）戊二醛法。将穿刺物直接注入生理盐水约20ml，2000r／min离心5～10min，弃去上清液，加3%戊二醛10ml，2000r／min离心5～10min，弃去上清液，用硬签直接挑出试管底凝结变硬的组织块，常规固定、脱水、包埋、组织切片。
3.液基薄层制片。目前对FNAC样本制备成液基薄片尚存争议，最大的问题在于液基制作后人为分散了细胞团，使细胞片内的残留组织学图像明显的减少，同时也使一些有诊断提示价值的间质、黏液、炎症细胞及特殊结构消失而增加了诊断的难度。其制片方法见相关章节。
4.其他制作方法：如制成细胞悬液作流式细胞学检查、FISH等。
（六）标本的固定
1.固定的目的。保持与细胞生活状态相仿的形态，防止涂片后细胞内的酶将蛋白质分解或细菌的作用而使细胞溶解，从而失去了原有的形态和结构。
2.固定方法
（1）湿固定法。绝大多数实验室的穿刺样本固定采用湿固定法，即在涂片完成后即刻将新鲜而又湿润的标本放入固定液内，越快越好。此类涂片染色后颜色鲜艳，结构清楚，H.E，巴氏染色等常规染色皆需采用此方法固定。
（2）喷雾固定。即湿固定法的改良。
（3）空气干燥固定法。仅适用于姬姆萨染色、瑞氏染色，由于细胞高度肿胀，核结构、形态与湿固定法大不相同。
（七）染色
1.常规染色（详见相关章节）。
2.快速染色法。
在FNAC中有较大应用价值的是Diiff‐Quik染色。该法最早用于鉴别寄生虫，近年来发现此类染色对FNAC检查实用价值巨大。由于其快速、简单且可永久保存，因此可作为FNAC样本初查、鉴定细胞数量多少、穿刺质量好坏的快速手段。通常是：
（1）甲醇固定（空气干燥后）：甲醇CK溶液；
（2）伊红缓冲液（EosinY）；
（3）美蓝缓冲液；
（4）水洗后即刻湿片镜检；
（5）有价值的涂片可二甲苯透明，封片后永久保存。
3.特殊染色法。
针吸细胞学材料除了主要做细胞形态学染色外，还可采用特殊染色对组织结构或细胞的特殊成分进行染色。作为常规染色的补充，常用的特殊染色如下（方法见总则及相关专业资料）：
（1）过碘酸席夫（PAS）染色。有助于确定糖原和PAS阳性物，此时被染成红色粗大颗粒或块状。
（2）黏蛋白胭脂红染色（黏液卡红）。有助于确定一些分泌黏液的原发性肿瘤，与Alicanblue（奥尔辛蓝）染色相似，而间皮瘤、肉瘤多呈阴性。
（3）苏丹Ⅲ染色。脂肪染呈橙红色，胞核淡蓝色。
（4）刚果红染色。淀粉样物染呈红色而核呈蓝色，有助于确定淀粉样变性。
（5）普鲁士蓝染色。含铁血黄素颗粒之中的铁着色呈蓝色，而核呈红色。
（6）FintanaMasson黑色素着色。
（八）免疫细胞化学（Immanocytochemistry，ICC）
ICC在细胞病理学中的应用原理与组织学完全相同，常在常规染色、特殊染色尚不能确定诊断时应用，合理应用ICC染色将对准确诊断起极大的指导作用。
1.染色原理与方法：见专业免疫组化资料。
2.ICC细胞学标本制备方法。
（1）常规涂片。必须注意①固定的时间不宜过长，否则易造成抗原丢失，常小于15min。
②建议应用丙酮，或10%中性福尔马林固定液，85%酒精也可应用。③已经过H.E或巴氏染色的涂片可进行ICC染色，无需脱色。
（2）细胞蜡块。相对于普通涂片，CB进行ICC染色有着明显的优势，其切片细胞相对集中，抗原暴露良好，清除了极大部分干扰着色的非特异性酶及蛋白，故染色的效果显着改善。
3.ICC染色结果的判定。
FNAC检查的ICC染色结果判定决定于细胞病理学专业人员的技术及经验。阳性反应一般是指棕褐色颗粒均匀地分布于单个或一组细胞，并且不同的抗体定位在不同的特异部位，如细胞膜、浆内、核内等。若弥漫性着色，淡褐色染色或细胞一片黄染等都是非特异性的。
4.常用抗体。参考专业外科病理学资料，推荐并结合各自实验室的自身条件配用。通常较多应用于细胞病理学的抗体有：
（1）乳腺：ER，PR，C‐erbB‐2，P53，P63，CK5／6，P10，Calponin，EGFR等。
（2）转移性癌：CEA，CK系列，EMA，HMB‐45，S‐100，VILLIN。
（3）甲状腺：降钙素，CT，NSE，TG，TTF‐1，Cg‐A，Syn，bcl‐2。
（4）肺：TTF‐1，Syn，NSE，CHG‐A，CK系列。
（5）肝：AFP，CD31或CD24（转移性肝癌多阴性），Hep。
（6）前列腺：PSA，P504s，CK34BE12，PSAP。
（7）软组织：Des，S‐100，HMB45，CD31，CD34，Actin等。
5.主要用途。
在FNAC中，ICC主要用于以下方面：
（1）对小圆细胞病变及软组织病变进行组织类型的分类。
（2）推断转移性肿瘤的原发灶。
（3）乳腺病变进行受体测定后指导治疗。
（4）淋巴瘤的初步诊断、分类。
（九）细胞DNA图像分析、分子病理学技术、流式细胞仪技术及电子显微镜技术（见相关章节）
（十）FNAC实验室安全及院内感染控制
与普通脱落细胞学检查院内感染控制不同的是在FNAC检查过程中尤须注意以下方面：
1.严格无菌操作规范：必须戴口罩、帽子，并戴手套操作。
2.设立医疗废物专用存放处及医疗污水排放专用下水道。
3.针具使用后毁形及销毁处理。
（1）针筒与针尖分离，针尖毁形后放入利器筒。
（2）针筒必须浸入密封的消毒筒内，用消毒液浸泡。
（3）专人负责两者的销毁处理并有完整记录。
4.感染性病变患者，尤其是结核、梅毒、肝炎、艾滋病等合并肿瘤，针吸后除常规处理外，同时须进行临时的环境及空气消毒，针具及器械应作相应的特殊处理。
5.控制操作室内人员的流动，重感冒、开放性、感染性创口人员避免进入细胞穿刺室。
6.实验室每天进行空气及环境消毒，记录时间，定期检测紫外线强度并作好记录。
7.FNAC实验室医疗垃圾处理原则（详见工作规范相关章节）。
三、针吸细胞学病理学诊断
（一）临床资料
FNAC诊断是一门实践性非常强的专业技术，必须密切结合相应的临床资料，应随时与临床医师密切保持配合沟通，只有这样才可能作出一个最接近正确诊断的细胞病理学报告。
我们认为应着重注意以下方面有助于FNAC诊断的临床资料：
1.病史。包括现病史、既往重大疾病史、病理检查、诊治过程等，也应关注家族史、月经史等，如猫、狗等动物抓伤史对诊断一个腋下淋巴结病变的性质可能起到关键的作用。
2.体征。应着重了解肿块的详细情况，包括部位、大小、数目、质地、边界、活动度、与周围血管的关系等，并结合其他的阳性体征。
3.影像学及其他辅助检查。乳腺、甲状腺的影像资料对提示肿块的性质极有帮助，一些实验室检查指标对提示肿块的性质也存在决定性的意义。
（二）阅片
必须指出FNAC涂片尤其应关注残留的组织学结构及涂片的背景，在认真、仔细、完整地观察镜下整个涂片情况的同时，既应注意低倍镜下整个细胞团块的结构观察，也应注意高倍镜下细胞细微结构变化。
（三）密切结合病理学辅助技术
这对提高诊断水平，提升实验室层次都是极为重要和关键的。
（四）细胞病理学诊断的书写规范（详见工作规范相关章节）
（五）常见部位针吸细胞病理学诊断及注意事项
1.淋巴结
淋巴结穿刺主要用于区分肿大淋巴结是良性病变、转移性肿瘤还是恶性淋巴瘤的可能。
（1）淋巴结良性病变
①急性淋巴结炎：
局部红、肿、痛等临床表现。
吸出物为浑浊液体或脓样。
镜下见大量脓细胞及细胞碎片，残留的淋巴细胞混杂其间。
②反应性淋巴组织增生：形态变化多端，一般可见的特点主要有：
淋巴细胞丰富，各个转化阶段的细胞均可见，以成熟小淋巴细胞为主。
组织细胞多见，吞噬反应常活跃，胞浆内常见吞噬颗粒。
不同数量的免疫母细胞增生，注意形态特点：核大而圆，核仁明显位于核中间。
不等量的浆细胞、各类粒细胞、滤泡中心细胞混杂存在。上述各类疾病均有各自的细胞形态特点，合适取材，常可作出细胞学诊断。细胞学诊断结节病应谨慎，必须密切结合临床。因为增殖性淋巴结结核，针吸标本有时无或仅有少许干酪样坏死物而被检查者忽视，而淋巴结结核在我国属常见病。
③特异性炎：主要指各类肉芽肿性炎。
Ⅰ.结核性淋巴结炎
成巢或松散分布的类上皮样细胞，其细胞形态特点为：核黄瓜样、毛虫样等，染色质细腻，核内可见嗜酸性小核仁，细胞浆丰富，界限不清。
50%以上病例可见Langhans多核巨细胞。
有或无成片出现的干酪样坏死。
反应性淋巴细胞数量不等。
抗酸染色（＋）。
Ⅱ.结节病
主要表现为成巢或松散分布的类上皮样细胞，多数病例可见Langhans多核巨细胞、大量成熟小淋巴细胞背景，巨细胞内可见两种类型的包涵体，即Schaumann小体和星形小体。
无干酪样坏死及抗酸染色（－）是结节病与结核性炎的主要区别，但由于后者也常无明显的坏死而鉴别困难。
Ⅲ.猫抓病
病因可能与Gram阴性杆菌感染有关，主要诊断要点如下：
猫、狗、兔等动物皮肤抓伤史，局部可有丘疹、破溃、结痂等表现。
引流部位的淋巴结肿大，大者可达8～10cm，常见滑车、腋下、颈部等。
镜下为典型的肉芽肿性炎及成簇的中性粒细胞，同时可见大量各个转化阶段的淋巴细胞。
必须注意在猫抓病不同阶段镜下形态有较大差异：从反应性增生到肉芽肿出现再到微脓肿形成，直到最后自愈。
（2）淋巴结转移性恶性肿瘤。以转移性癌最常见，且诊断亦容易，在大多数情况下可避免小手术活检。根据癌细胞形态、分化程度及淋巴引流范围并结合临床，常可确定或提示其原发部位及其组织学类型。转移性无色素性黑色素瘤，易误诊为腺癌，结合临床提示的原发病灶或追踪有关病史有助于明确诊断。必要时可做辅助诊断检查或活检证实。
